Artículo de Karina Horgan1
, Shauna McKelvey1
y Kate Jacques2
1
Alltech Bioscience Centre, Dunboyne,
Co. Meath, Irlanda
2
Nutrigenomics Centre, Alltech Inc,
Nicholasville, Kentucky, EE. UU.
Las células epiteliales del intestino forman una monocapa que recubre el intestino y tienen un papel primario en la protección frente a la exposición a patógenos. Hay diferentes mecanismos que reducen el riesgo de infección, como la función de barrera. En porcino, las infecciones por Salmonella dañan la función de barrera del epitelio intestinal. Existen fracciones ricas en mananos de levaduras que se parecen a los receptores que recubren el intestino, a los que patógenos como Salmonella se adhieren, por lo que evitan la infección. El objetivo de este estudio fue determinar si una fracción rica en mananos comercial, extraída de levaduras (MRF, Actigen), puede ayudar a mantener la barrera epitelial del intestino.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se sembraron células epiteliales del intestino del cerdo (IPEC J2) entre los pases 2 y 18
en un sistema transwell (Costar, 1,12 cm²)
recubierto en colágeno, a una densidad de
2×105 células/pocillo, con medio DMEM/
F12 suplementado con 2 % de suero fetal
bovino o suero porcino, 2mM de L-glutamina (Gibco), 1× ITS (insulina, transferrina
y selenio, Gibco), 100 I/ml de penicilina y
100 µg/ml de estreptomicina (P/S, Gibco), y
5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF, Sigma) a 37 °C y 5 % de CO2 en
una atmósfera humidificada.
Se sembraron pocillos por triplicado para
el control y el tratamiento con MRF.
Se
observó una diferenciación de las monocapas a los 9 días in vitro, tras la determinación de la resistencia transeléctrica
(TEER) con un medidor EVOM (World
Precision Instruments, EE. UU.). La
TEER (TEER = [Resistencia-Resistencia
basal]×área de la membrana) se determinó todos los días mediante un voltímetro
epitelial hasta que se alcanzó un valor de
20.000 ohm/m² o superior.
El día 14 de la diferenciación, las células
se trataron con una dilución 1/10 de MRF,
que se sometió a un método de digestión
porcina simulada in vitro, donde se digirieron 0,5 g de MRF en un volumen de 14 ml
El día 15 de la diferenciación, las células
se expusieron al LPS de Salmonella (1 μg/
ml). Se controló la integridad de la membrana mediante la TEER.
Las células del día 16 se recogieron de
los pocillos, y se extrajo el ARN de cada
muestra usando el kit RNeasy. Se analizó
la pureza del ARN extraído mediante un
bioanalizador Agilent, y las muestras con
una integridad de 7 o más se consideraron adecuadas para análisis. Se generó
ADNc y se diluyó para análisis de expresión génica usando RT-PCR. Los genes
analizados fueron:
- Proteína de unión estrecha (TJP1), implicada en la transducción de la señal en las uniones entre células.
- Ocludina (OCLN), mantiene las propiedades de barrera de la unión estrecha.
- Hipoxantina ribosiltransferasa (HPRT)
como gen de control endógeno.
RESULTADOS
Tras la exposición al LPS se redujo la
TEER de las células control y MRF; de
30.000 y 41.000 ohm/m² pasaron a
9.100 y 9.000 ohm/m², respectivamente
(figura 4). Las células tratadas con MRF
recuperaron su TEER con una lectura
de 20.500 ohm/m² después de la exposición al LPS (p <0,05), pero no se observó recuperación en las células de control
8.700 ohm/m².
El análisis de la expresión de los genes
asociados a la integridad de la membrana
y la función de barrera, como el gen de
la proteína de unión estrecha y la ocludina, también se midieron (figura 5). Los
niveles de expresión del gen de proteína
de unión estrecha (TJP1) aumentaron tres
veces en las células tratadas con MRF en
comparación con las células control expuestas a LPS (p <0,05). El nivel de expresión de la ocludina también fue 1,5 veces
mayor que el control.
CONCLUSIÓN
Se sabe que las proteínas de unión estrecha y la ocludina desempeñan un papel
fundamental en la función de barrera. El
aumento en su expresión después de la
administración de suplementos de MRF
junto con la recuperación de la TEER
puede indicar que la MRF puede tener un
impacto positivo en la barrera del epitelio
intestinal.
